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昕大洋復(fù)合酶的分子生物學(xué)特性
木聚糖酶、纖維素酶和甘露聚糖酶為昕大洋ＮＳＰ復(fù)合酶中最重要的三種組分。三株單酶菌種均利用自然選擇法從特定環(huán)境中篩選得到，后經(jīng)過原生質(zhì)體復(fù)合誘變育種技術(shù)，獲得耐熱耐酸并具有優(yōu)良抗逆性的高產(chǎn)高效菌株。本文就三種單酶的分子生物學(xué)特性進(jìn)行介紹。
一、木聚糖酶水解效率高抗逆性強(qiáng)
昕大洋的木聚糖酶基因xynX,由1484 bp組成,其中包含10個內(nèi)含子,編碼一個由327個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量約為36 kDa，這種高分子量木聚糖酶(>30 kDa)屬于F/10族。這一家族的酶除了有內(nèi)切-1,4-β-木聚糖酶活性外，還包含少量的內(nèi)切-1,3-β-木聚糖酶活性，對木聚糖的水解速度快，且產(chǎn)物為聚合度1-5 Dp左右的低分子量的寡糖，該族不僅具有木聚糖酶活性，還能作用于一些短鏈的纖維素底物；而市面上的低分子量木聚糖酶多數(shù)屬于G/11族，對木聚糖的水解速度慢，產(chǎn)物為聚合度5-10 Dp左右的木寡糖。
目前，木聚糖酶的應(yīng)用效果不穩(wěn)定，原因除了其熱穩(wěn)定性不足之外，還有一個重要的原因就是植物細(xì)胞中存在一種對木聚糖酶起抑制作用的蛋白質(zhì)，在谷物細(xì)胞中這種抑制蛋白廣泛存在，且分布于谷物的各組織中。研究發(fā)現(xiàn)，小麥、燕麥、黑麥、玉米當(dāng)中都存在木聚糖酶抑制蛋白。 在谷物中小麥所含的抑制蛋白量最高，且在富含糊粉的組分中含量最高，在該組織中的含量是白面粉組分的 4 倍，是富含皮層組分的十倍。為了降低抑制蛋白對木聚糖酶的抑制作用，我們應(yīng)用化學(xué)修飾的實驗方法并結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的模擬計算對木聚糖酶蛋白中的氨基酸殘基進(jìn)行選擇性化學(xué)修飾。在對蛋白序列中的的谷氨酸和天冬氨酸進(jìn)行化學(xué)修飾的同時保護(hù)活性中心的色氨酸不被修飾，從而改變了木聚糖酶與抑制蛋白的結(jié)合位點，顯著降低了抑制蛋白對酶與底物結(jié)合位點的覆蓋，保障木聚糖酶分解活性的正常發(fā)揮。同時，通過化學(xué)修飾使的蛋白序列中的氫鍵和鹽橋數(shù)有所增加，進(jìn)一步提高了木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。
二、甘露聚糖酶作用底物廣泛
不同來源的β-甘露聚糖酶由于產(chǎn)酶生物的種類、生活環(huán)境、生存方式等方面的不同在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能上存在一定的差異。昕大洋甘露聚糖酶的底物作用范圍廣，其產(chǎn)生的β-甘露聚糖酶為多分子型，即可產(chǎn)生幾種同工酶，并且它們之間有著一定的互補(bǔ)關(guān)系。我們從產(chǎn)酶菌株出發(fā)，克隆得到甘露聚糖酶的基因序列，該基因包含一個完整的開放閱讀框（ORP），編碼337個氨基酸，在N端有一個信號肽序列，在閱讀框的前面有明顯的核糖體結(jié)合序列和啟動子序列。值得注意的是β-甘露聚糖酶基因開放閱讀框能產(chǎn)生不止一種的β-甘露聚糖酶，它們經(jīng)過了不同的轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白加工修飾可產(chǎn)生多分子的甘露聚糖酶。該甘露聚糖酶蛋白包括兩個功能結(jié)構(gòu)域，即一個N端甘露聚糖酶催化結(jié)構(gòu)域和一個C端碳水化合物結(jié)合域（CBM），其中CBM具有結(jié)合并促進(jìn)纖維素降解的作用，氨基酸序列比對的結(jié)果顯示該酶與糖苷水解酶家族5的β-甘露聚糖酶同源性較高。利用同源建模的方法對甘露聚糖酶的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，相關(guān)活性位點得到了確認(rèn)，甘露聚糖酶中的巰基、酪氨酸殘基和色氨酸殘基是維持酶活性的必需基團(tuán)，酶的催化域采用一定的折疊方式形成TIM桶狀結(jié)構(gòu)，且兩個半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵，因此該酶具體較高的熱穩(wěn)定性。
三、纖維素酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不易變性
纖維素酶是將纖維素水解成纖維二糖和葡萄糖的一組復(fù)雜酶系的總稱，包括：內(nèi)切葡聚糖（EG）酶，外切葡聚糖酶（CBH）和β-葡萄糖苷酶（BG）。纖維素的完全水解，是這三種酶的協(xié)同作用，內(nèi)切葡聚糖酶隨機(jī)切割纖維素多糖鏈內(nèi)部的無定型區(qū)，產(chǎn)生不同長度的寡糖和新鏈的末端。外切葡聚糖酶作用于這些還原性和非還原性的纖維素多糖鏈的末端，釋放葡萄糖或纖維二糖。β-葡萄糖苷酶水解纖維二糖產(chǎn)生葡萄糖分子。
纖維素酶具有兩個獨(dú)立的活性結(jié)構(gòu)域: 具有催化功能的催化域(CD)和具有結(jié)合纖維素功能的纖維素結(jié)合域(CBD) 。CBD在纖維素酶中位于氨基端或羧基端，它通過一段高度糖基化的連接橋與 CD 相連。CBD使纖維素酶結(jié)合于纖維素表面，使得臨近的 CD 易于接近底物，促進(jìn)底物的水解。從產(chǎn)酶菌株出發(fā)，分別克隆得到三個纖維素酶基因：Bg-1，CBH-2，和EG-3，它們所編碼的蛋白分別由425，370和460個氨基酸組成，分別屬于糖基水解酶家族1，9和7。每個氨基酸序列中均含有多個N端糖基化位點，蛋白激酶C磷酸化位點、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、N端?；稽c、糖基水解酶家族的N端特征序列以及纖維素結(jié)合域。糖基化可增加蛋白質(zhì)對各種變性條件（變性劑、熱等）的穩(wěn)定性，防止蛋白質(zhì)相互聚集，同時可覆蓋蛋白質(zhì)分子中的某些蛋白酶降解位點，從而增加蛋白質(zhì)對于蛋白酶的抗性，蛋白表面的糖鏈也可提高蛋白質(zhì)的可溶性。磷酸化和?；蛇M(jìn)一步改變蛋白質(zhì)的多肽結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，對蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定以及酶活的保持和激活有一定作用。因此，昕大洋纖維素酶無需后加工處理即具有高穩(wěn)定性和高耐受性。
昕大洋木聚糖酶、纖維素酶和甘露聚糖酶的產(chǎn)酶菌株經(jīng)過合理的篩選以及優(yōu)良的選育后獲得，具有產(chǎn)酶能力強(qiáng)且高效安全的特性。從基因序列及分子結(jié)構(gòu)分析中，發(fā)現(xiàn)三種酶的具有水解效率高、抗逆性強(qiáng)、高耐受性且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等特點，因此特別適合在動物飼料中的應(yīng)用。昕大洋NSP酶可有效補(bǔ)充動物內(nèi)源酶的不足，消除飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，加大非常規(guī)原料的用量，提高飼料消化率，提高動物養(yǎng)殖效益，促進(jìn)畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。
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