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提高植酸酶熱穩(wěn)定性的技術途徑及產品評測方法
制粒是常用的飼料加工工藝，通過制粒改善飼料適口性，提高飼料利用率，保證動物均衡采食營養(yǎng)素和提高生長速度，同時在壓制過程中實現高溫殺菌。在制粒過程中，通常會通入一定壓汽，從而使粉料在進入環(huán)模制粒前達到較高的溫度，即調質過程。粉料溫度的測定點一般緊靠在調質器的出口處，這里測定的溫度也就是通常所說的制粒溫度，理想的制粒溫度范圍在80-90℃。而實際使用的蒸汽溫度則遠高于此，濕蒸汽、飽和蒸汽和過熱蒸汽的溫度分別可以達到100、140和160℃，同時粉料通過制粒機環(huán)模后溫度也會因摩擦力而增加。此外，蒸汽調質時的高濕環(huán)境增強了熱能的傳遞。這些都對飼料中的熱敏性因子，如植酸酶產生極大的破壞。
制粒對植酸酶的破壞源于高溫對其空間結構的破壞，目前飼料上應用的植酸酶大部分屬于酸性磷酸酶家族，其空間上包含兩個結構域，因植酸酶的菌種來源不同，其包含的α、β結構數量不一，如無花果曲霉植酸酶的結構是由一個較大的α、β結構域和一個小的α結構域組成，α、β結構域是由5個α螺旋和8個β折疊構成，α結構域是由4個α螺旋組成。而大腸桿菌植酸酶的兩個結構域一個是由5個α螺旋和2個β折疊組成，另一個是由6個α螺旋和9個β折疊組成。植酸酶活性部位的氨基酸序列具有高度保守性，其間的氨基酸被修飾或突變后都會導致酶活性的喪失，但高溫的影響則在于去折疊效應。
植酸酶目前已通過基因工程微生物發(fā)酵實現了大規(guī)模廉價生產，而今，生物工程技術也為解決植酸酶的熱穩(wěn)定性提供了很好的途徑。同時研究發(fā)現，一些分子能通過化學修飾有效提高植酸酶的熱穩(wěn)定性。此外，新型包被技術和包被材料的應用進一步提高了植酸酶熱穩(wěn)定性。
1、生物工程技術設計制造耐熱植酸酶菌株
自然界產生植酸酶的微生物多種多樣，每種植酸酶的性質各不相同，自然界中存在的煙曲霉、淀粉液化芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等中分離到的植酸酶都能耐受高溫，但都在37℃時酶活性極低，缺乏飼用價值（見表1）。
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來源 |
最適溫度℃ |
熱穩(wěn)定性 |
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無花果曲霉 |
58 |
最高可以耐受65 ℃的高溫 |
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煙曲霉 |
70 |
100 ℃下加熱20 min 后，酶活僅損失10 % |
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米曲霉 |
56 |
65 ℃時酶活損失80 % |
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淀粉液化芽孢桿菌 |
60 |
90 ℃處理10 min 后酶活可保留50 % |
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地衣芽孢桿菌 |
65 |
95 ℃處理15 min 后酶活可保留61 % |
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枯草芽孢桿菌 |
55 |
60 ℃處理1 h，活性減少90 % |
植酸酶的耐熱性是受基因控制且可以遺傳的。隨著基因工程技術及分子生物學技術的發(fā)展，蛋白質工程法逐漸成為人們研究蛋白質穩(wěn)定性的主要手段。目前在蛋白質熱穩(wěn)定性工程中常用的方法為：推理設計、同序概念、雜合酶和定向進化。
推理設計主要是把熱穩(wěn)定蛋白與熱不穩(wěn)定蛋白的氨基酸序列進行比較，分析究竟是哪些氨基酸對蛋白質的熱穩(wěn)定性起關鍵作用。對耐熱與常溫植酸酶蛋白的研究發(fā)現二者分子量的大小、亞基結構、螺旋程度、極性和活性中心都極相似，但耐熱酶蛋白中亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸和精氨酸含量均高于常溫菌所產植酸酶，而胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、谷胺酰胺和天門冬氨酸含量顯著低于常溫酶蛋白。這是因為脯氨酸結構熵小而易折疊，且一經折疊后則需要很高的能量才能解開，從而提高蛋白質穩(wěn)定性。谷氨酸和精氨酸分別比帶同樣電荷的氨基酸有更大的側鏈，側鏈所提供的疏水作用及離子間互相作用能提高蛋白質的穩(wěn)定性。亮氨酸具有較強的疏水性和較大的側鏈。目前通過基因定向突變，將植酸酶鄰近活性中心的部分氨基酸突變?yōu)楦彼?，已經成功的提高了植酸酶的熱穩(wěn)定性。由于脯氨酸易形成β折疊，從而使構象更穩(wěn)定牢固，在穩(wěn)定蛋白質結構和提高酶熱穩(wěn)定性方面具有不可忽視的作用。
同序概念是一種半推理的方法，是對一組同源蛋白質的氨基酸序列進行比較，以一定的標準程序計算各氨基酸序列，從中選擇對每個氨基酸位點最保守的殘基，拼成序列，然后將最后確定的氨基酸序列翻譯成相應的堿基序列，最后選用合適的表達系統(tǒng)對這個“人造的”目的基因進行表達。該方法能減少有害突變，也不需要進行高通量的篩選，但設計過程難度較大。
雜合酶技術是把來自不同酶分子的結構單元如二級結構、三級結構或功能域進行組合或交換以產生具有所需要性質的優(yōu)化酶雜合體結構，組合出新酶。目前已經有技術將土曲霉來源的植酸酶表面的一個二級結構α螺旋用黑曲霉植酸酶上相應長度的一段序列替換，獲得了酶活性未變而熱穩(wěn)定性提高的新植酸酶。其原理是因為α螺旋中氨基酸改變導致疏水作用變化，增加了熱穩(wěn)定性。因對雜合的片段相似性要求高，雜合酶技術主要應用于對同源蛋白的穩(wěn)定性加以改善。
定向進化主要包括多輪隨機突變和DNA改組技術。多輪隨機突變是以目的基因進行第一輪隨機突變，然后篩選出最佳突變子作為下一輪突變的親本，如此循環(huán)下去獲得性狀優(yōu)良的突變體。DNA改組技術是指DNA分子的體外重組，通過改變單一或多個基因原有的核苷酸序列，創(chuàng)造新基因，并賦予表達產物以新功能。實際上是一種分子水平上的定向進化，因此，也稱為分子育種。該方法可在短時間內通過重組有效的變異體發(fā)掘所有可能的重組體與突變序列，但需要建立有效的試驗方法進行篩選。
2、植酸酶分子的化學修飾
酶分子的化學修飾是一種提高酶熱穩(wěn)定性的重要手段。根據X射線對植酸酶晶體衍射結果表明，其分子表面約一半是由疏水氨基酸占據著。從熱力學角度看，疏水氨基酸與水分子接觸對酶熱穩(wěn)定性不利。因為分子中的氫鍵在維持酶的空間構象中起著重要的作用，當體系中含有大量的自由水時，就會破壞酶分子內部的氫鍵，使酶分子構象容易發(fā)生變化和變性失活。
金屬離子的添加能顯著改善酶的熱穩(wěn)定性?？稍诿傅幕钚灾行暮须x子配位體時，通過離子鍵與其結合穩(wěn)定酶的構象。此外金屬離子還可作為水分子的替代物占據水的位置，排除自由水對酶造成的不穩(wěn)定化影響。但金屬離子對植酸酶的熱穩(wěn)定性的影響比較復雜。研究發(fā)現在甲醇酵母植酸酶液中添加CaCl2，80℃處理20分鐘后，加入10mmol CaCl2的酶液比加入5mmol CaCl2的相對酶活高約30%。多數研究認為，陰離子的熱穩(wěn)定作用是SO42->Cl- >Br- >NO3-，陽離子是(CH3)4N+>NH4+>K+、Na+>Mg2+>Ca2+>Ba2+。
多羥基化合物既可通過氫鍵與酶蛋白表面分子相連結，也能通過氫鍵有效地與外部水分子相連結，使酶蛋白分子穩(wěn)定，它包括多羥基醇、糖類等化合物。多羥基醇有乙二醇、甘油、甘露醇、木糖醇、山梨醇等，糖類有麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖等。研究糖對植酸酶熱穩(wěn)定性的影響發(fā)現，加入甘露醇、葡萄糖、海藻糖均能提高植酸酶在高溫下的熱穩(wěn)定性，與不加糖相比，酶活力保留率提高10%左右。有研究發(fā)現在植酸酶溶液中加入可溶性淀粉和高粱糖漿廢棄液也可以提高植酸酶的熱穩(wěn)定性。其原因可能是高粱糖漿廢棄液和淀粉阻止了傳熱，對酶起到了一定的保護作用。
3、新型包被技術和包被材料
制粒過程中的水分是影響植酸酶熱穩(wěn)定性的一個非常關鍵的因素。完全干燥的植酸酶的去折疊溫度為165℃；當水分增加到12%時，去折疊溫度迅速降為95℃；當水分增加到16%時，去折疊溫度降為88℃。而包被技術則是將包被材料在物質表面形成一層堅固疏水的薄膜層以提高植酸酶的熱耐受能力。
包衣材料的選擇很關鍵，既要求其能耐受高溫高濕，又要在消化道能迅速釋放發(fā)揮作用。植酸酶包衣材料可分為水溶性和脂溶性兩類。選用水溶性包衣劑如纖維素可以保證在消化道中能快速溶解和釋放植酸酶，但其耐濕能力差。而選用脂溶性包衣劑，如脂肪酸鹽則可以更有效地阻止?jié)駸岬膫鬟f，但包衣需經脂肪酶的作用才能大量釋放。目前對包衣材料的選擇需選擇復合包衣材料，即在脂溶性包衣劑中混合入崩解劑。崩解劑有很強的疏水性，其特點是在一定的pH下能迅速破裂，釋放出其包被物質。
植酸酶包被多數采用多層包被以提高其熱穩(wěn)定性。植酸酶的載體一般選擇纖維素、碳酸鈣、糊精、淀粉等，經混合、擠壓、切割、圓整、低溫干燥和篩分，制成含酶小顆粒。然后再采用流化床噴涂氫化牛油、明膠等物質。試驗數據顯示，植酸酶經包被后在干熱的情況下殘存酶活性比原酶提高8.7%，而濕熱的情況下殘存酶活性則提高58.3%。由此可見，采用包被技術提高植酸酶熱穩(wěn)定性的效果明顯。
4、植酸酶熱穩(wěn)定性評價方法的研究
最直接的植酸酶熱穩(wěn)定性的評價方法是經過制粒生產來測定其存留率，此外也可以通過實驗室的模擬試驗來評估。目前，實驗室評價溫度對植酸酶活性影響的方法主要有三種，即水浴法、干熱法和濕熱法。
水浴法即通過調節(jié)水浴鍋中水溫和植酸酶溶液水浴時間來評估溫度對其活性的影響。此方法簡便但因其必需使用植酸酶溶液，其實是已經將酶蛋白直接暴露在高溫和高濕環(huán)境中，所測存留率要低的多。特別是對采用包被技術的產品，水浴法評估的結果與實際制粒條件下差異非常大。
干熱法是將植酸酶在干燥箱里設定一定的溫度處理一定時間，測定該溫度下植酸酶活性損失。但由于忽視了水分的作用使得測定值偏高。
濕熱法在干熱法基礎上加入濕度因子，使其更接近實際調質和制粒情況。濕熱法需先測定植酸酶樣品中水分含量，然后據其水分含量均勻添加純化水調節(jié)待處理樣品水分至16%，再置于恒溫箱中處理一定時間。
濕熱法對有效評價制粒過程中植酸酶存留率具有重要的應用價值。通過對實際生產制粒和實驗室評估的結果對比發(fā)現，水浴法、干熱法和濕熱法評估結果與實際制粒條件下酶活存留率的相關系數分別是r=-0.62、r=0.09、r=0.97，可見，水浴法評估結果與實際檢測結果相關性最差而濕熱法能很好地反映實際制粒過程中酶活變化情況，是一種相對有效的實驗室植酸酶熱穩(wěn)定性的評價方法。
5、結語
植酸酶對降低飼料成本、減少環(huán)境污染和保護生態(tài)環(huán)境具有重要意義。通過深入研究植酸酶蛋白的結構與熱穩(wěn)定性的關系，對熱穩(wěn)定性基因進行定位和重組，篩選出有效的耐高溫菌種，同時綜合運用蛋白質熱穩(wěn)定性工程中的各種方法，以及選擇合適的酶制劑包被工藝和包被材料，降低植酸酶在飼料制粒過程中的損失，擴大植酸酶的應用范圍，更全面的發(fā)揮植酸酶的經濟效益、社會效益和生態(tài)效益。
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