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甲醇營(yíng)養(yǎng)型巴斯德畢赤酵母的認(rèn)識(shí)
酵母是單細(xì)胞真核微生物，其遺傳操作簡(jiǎn)單，對(duì)翻譯后的蛋白質(zhì)有加工修飾的能力，因此在生物技術(shù)表達(dá)外源蛋白方面是一個(gè)很有吸引力的表達(dá)系統(tǒng)。與原核表達(dá)系統(tǒng)如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等相比，酵母有先進(jìn)的外源蛋白折疊系統(tǒng)、較強(qiáng)的分泌能力和后加工能力；與動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比，酵母可以在簡(jiǎn)單的合成培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并且生長(zhǎng)速率快、成本低。酵母表達(dá)系統(tǒng)中主要有常規(guī)的釀酒酵母和非常規(guī)的酵母，后者主要有以甲醇為唯一碳源能源的甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母和能以乳糖為唯一碳源能源的乳酸克魯維酵母。我們公司用于發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶的菌株就是屬于甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母的巴斯德畢赤酵母，該酵母在近年的研究中表現(xiàn)出很廣泛的應(yīng)用前景。
巴斯德畢赤酵母的生物學(xué)特點(diǎn)
畢赤酵母屬的細(xì)胞呈短橢圓行或圓柱形，多邊芽殖，有些種形成假菌絲，有性繁殖時(shí)會(huì)形成子囊孢子。巴斯德畢赤酵母是一種可以在以甲醇為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的酵母菌，因?yàn)槠浼?xì)胞中的過氧化物酶體中含有甲醇代謝途徑的必需酶，如醇氧化酶、二羥丙酮合成酶和過氧化氫酶等，其中醇氧化酶（AOX）是甲醇利用途徑中的第一個(gè)酶，該酶受到葡萄糖、甘油和乙醇等碳源的阻遏。
甲醇營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母在以甲醇為唯一碳源生長(zhǎng)時(shí)，首先甲醇在醇氧化酶的作用下被氧化成甲醛和過氧化氫，然后甲醛被氧化成甲酸，并生成二氧化碳，過氧化氫則在過氧化氫酶的作用下變成水和氧氣；另外，生成的甲醛還可以通過木酮糖單磷酸途徑被同化成磷酸二羥丙酮和磷酸甘油醛。這兩種代謝途徑都能為細(xì)胞生長(zhǎng)提供能量和細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)。
甲醇營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母的優(yōu)勢(shì)
甲醇營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母與重組釀酒酵母比較具有以下優(yōu)勢(shì)：
(1)具有精確調(diào)控的啟動(dòng)子，可以精確表達(dá)目的外源蛋白；
(2)表達(dá)效率高，其表達(dá)的外源蛋白可占總表達(dá)蛋白的90％以上，有利于目的蛋白的分離純化；
(3)在簡(jiǎn)單合成培養(yǎng)基中可實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)；
(4)由于該酵母可以以甲醇為唯一的碳源和能源，而絕大多數(shù)微生物并不能以甲醇為碳源，這樣就可以極大程度地降低雜菌在發(fā)酵液中的繁殖量，減小其對(duì)正常發(fā)酵的不利影響。因此，甲醇營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母是近年來作為表達(dá)外源目的蛋白最有前途的表達(dá)系統(tǒng)。
外源蛋白在甲醇營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母中的表達(dá)
畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)外源蛋白的過程一般包括3個(gè)階段：(1)細(xì)胞增殖階段，細(xì)胞在含有易利用碳源（如葡萄糖、甘油等）的培養(yǎng)基中快速繁殖以積累生物量；(2)分批流加的過渡階段，在此階段中向培養(yǎng)基中限制性流加葡萄糖、甘油等碳源，進(jìn)一步積累細(xì)胞量，為誘導(dǎo)表達(dá)做準(zhǔn)備；(3)誘導(dǎo)表達(dá)階段，以限制性速率流加甲醇或甲醇與葡萄糖、甘油等的混合液，誘導(dǎo)表達(dá)外源目的蛋白。各階段碳源都為限制性基質(zhì)，其補(bǔ)加速率的動(dòng)力學(xué)模型是高效表達(dá)的基礎(chǔ)。
應(yīng)用前景及局限性
巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的諸多優(yōu)勢(shì)使之越來越受到關(guān)注，其研究?jī)r(jià)值和商業(yè)價(jià)值亦不斷體現(xiàn)。在載體構(gòu)建和新型菌株的開發(fā)方面，已經(jīng)取得了卓有成效的研究成果。但是作為一種新的表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母也存在一些不足之處，如發(fā)酵周期長(zhǎng)；利用易燃易爆有毒的甲醇做原料，生產(chǎn)過程和表達(dá)產(chǎn)物的衛(wèi)生安全性需要考慮；篩選高產(chǎn)菌株需用的藥物價(jià)格比較昂貴，也給生產(chǎn)應(yīng)用帶來局限；另外，表達(dá)過程的控制和培養(yǎng)基配方等尚有待于進(jìn)一步開展開創(chuàng)性的探索研究，突破傳統(tǒng)培養(yǎng)發(fā)酵模式，優(yōu)化培養(yǎng)基配方，為提高外源蛋白的表達(dá)量作出積極有益的探索。因此還需要對(duì)此表達(dá)系統(tǒng)做更深入的研究，相信隨著對(duì)甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母表達(dá)機(jī)制的進(jìn)一步了解，在不久的將來它必將在分子生物學(xué)以及工業(yè)發(fā)酵的各個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。
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